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從理想到現(xiàn)實(shí) | 一個(gè)追光者的STED使用史

更新時(shí)間：2024-05-27 點(diǎn)擊次數(shù)：920

李曉明（上海科技大學(xué)）

科學(xué)和技術(shù)的關(guān)系是科學(xué)史專(zhuān)家們喜歡討論的課題，它們互相融合、互相促進(jìn)、互相激發(fā)，一起促進(jìn)了社會(huì)的進(jìn)步。傳統(tǒng)的科學(xué)史專(zhuān)家偏向認(rèn)為科學(xué)發(fā)展是范式轉(zhuǎn)換，經(jīng)常由深刻的創(chuàng)新思想驅(qū)動(dòng)^[1]；而近百年或者近五十年來(lái)的科技發(fā)展也表現(xiàn)出另外一種態(tài)勢(shì)，即新技術(shù)打開(kāi)新的研究領(lǐng)域或新的研究維度。光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展便是其中一個(gè)典型案例，這個(gè)領(lǐng)域內(nèi)的進(jìn)步并非是基礎(chǔ)的哲學(xué)、數(shù)學(xué)或物理學(xué)上的重大理論突破，而是利用已有理論提高人類(lèi)研究在空間和時(shí)間的分辨率、拓寬研究組分的類(lèi)別，從而構(gòu)建出可研究的微觀(guān)xin時(shí)空。

科學(xué)家（使用者）們對(duì)科技的的需求是多元化的，zuilixiang的技術(shù)是可以同時(shí)檢測(cè)所有感興趣組分隨在各個(gè)時(shí)空維度上、各種尺度上的動(dòng)態(tài)變化。另一方面，技術(shù)研發(fā)者們希望展現(xiàn)他們的技術(shù)在某個(gè)維度上的jizhi展現(xiàn)，這需要將技術(shù)局限在某個(gè)特定時(shí)空維度上來(lái)展現(xiàn)有限且特定的組分變化。

2009年Nature Milestones歷數(shù)了光學(xué)成像領(lǐng)域從1595年到2006年的技術(shù)里程碑，敘述了顯微成像技術(shù)和標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，展現(xiàn)了技術(shù)和需求的碰撞一步步推動(dòng)了科學(xué)家們探索多種目標(biāo)組分在多維度時(shí)空的分布和變化的發(fā)展史，將自然科學(xué)的研究引入了新的時(shí)空^[2]。而我們也看到了這些技術(shù)對(duì)科學(xué)特別是生命科學(xué)的進(jìn)步起到了極大的推動(dòng)作用，很多技術(shù)應(yīng)用至今仍然不可或que。同所有在后來(lái)發(fā)揚(yáng)光大的那些技術(shù)一樣，受激發(fā)射損耗顯微鏡（Stimulated Emission Depletion，STED）超高分辨率成像技術(shù)也在研發(fā)者和使用者的拉扯中經(jīng)歷了從理想到現(xiàn)實(shí)的歷程。

STED 的發(fā)明

超高分辨帶來(lái)超高理想

極限就是用來(lái)打破的。當(dāng)阿貝提出分辨極限以后^[3]，成像科學(xué)家們就希望發(fā)展從多角度切入以突破光學(xué)衍射極限，上世紀(jì)九十年代前后涌現(xiàn)出多種超高分辨率顯微成像技術(shù)，將基于光學(xué)成像技術(shù)的科學(xué)研究慢慢帶進(jìn)了納米尺度空間。其中，1994年Stefan Hell就發(fā)文章闡述了使用受激輻射技術(shù)來(lái)突破分辨率的理論和STED顯微鏡搭建理論^[4]，2001年便報(bào)道了使用不同形狀的受激幅射光來(lái)突破分辨率極限的STED顯微鏡^[5]。這項(xiàng)技術(shù)的突破給科研工作者們提供了更高維度的研究可能，獲得了2014年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。而STED超高分辨率成像技術(shù)也開(kāi)始了20年來(lái)的打怪升級(jí)，從給科學(xué)家們帶來(lái)眾多科研想法和可能性的研究成果慢慢進(jìn)化成易用、穩(wěn)定的成熟商業(yè)產(chǎn)品。我們可以看到這項(xiàng)技術(shù)從理想到現(xiàn)實(shí)、從單維度到多維度的蛻變，STED成像技術(shù)應(yīng)用的領(lǐng)域越來(lái)越多，解決的問(wèn)題越來(lái)越復(fù)雜。

SP5 時(shí)代

從單色STED到多色STED

STED走進(jìn)市場(chǎng)是2007年SP5時(shí)代的TCS STED，我第一次接觸已經(jīng)是幾年后的TCS STED CW了。那時(shí)候只有雙光子和氬離子激光器作為激發(fā)光的Pulsed STED和CW STED，受激輻射光好像也只有592nm的激光。現(xiàn)在回頭看，那時(shí)候的技術(shù)只能做折射率適合、592nm光吸收低、標(biāo)記信號(hào)極亮的、激發(fā)光為458-514nm之間的熒光樣品成像，而這時(shí)候商業(yè)化產(chǎn)品的guanfang宣稱(chēng)分辨率只有80nm。

那時(shí)候大家試圖在百納米分辨率以?xún)?nèi)研究細(xì)胞組分的相互作用的話(huà)，只能選擇類(lèi)似BD Horizon V500和Alexa 488這種極易串色的染料組合，那時(shí)候的protocol里甚至還有串色拆分的教程。但是有和無(wú)的差別，已經(jīng)很震撼了，至少研究者們可以嘗試在百納米光學(xué)分辨率的空間里進(jìn)行分析研究了。

圖1. 早期雙色STED的protocol

2010年前后，隨著STED染料的研發(fā)、脈沖白激光的使用和受激輻射激光的選擇變多，研究者們發(fā)現(xiàn)使用750nm波長(zhǎng)的激光器可以對(duì)ATTO 647N和 ATTO 655等紅外熒光染料進(jìn)行更有效的光損耗，而且在592nm受激輻射光成像時(shí)由樣品或封片劑等原因造成的信號(hào)模糊也明顯減輕了。一方面研究者們可以選擇成像效果更好的紅外染料進(jìn)行單色STED，也可以使用750nm和592nm受激輻射光的聯(lián)用來(lái)實(shí)現(xiàn)2-3個(gè)通道的STED成像了。

SP8 時(shí)代

對(duì)生物用戶(hù)使用門(mén)檻降低的STED

2016年我的身份由方法學(xué)科研工作者轉(zhuǎn)變?yōu)槠脚_(tái)技術(shù)人員，這時(shí)期的STED也在前一年進(jìn)入了SP8平臺(tái)時(shí)代，生物用戶(hù)們發(fā)現(xiàn)基于SP8的STED越來(lái)越容易上手了。2014年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)讓領(lǐng)域的科研工作者們了解了STED等超高分辨率顯微鏡技術(shù)，而經(jīng)過(guò)十年的發(fā)展這時(shí)候基于白激光+HyD檢測(cè)器的SP8新平臺(tái)已經(jīng)非常成熟，推出了很多項(xiàng)對(duì)生物用戶(hù)友好的商業(yè)化技術(shù)。

首先讓人印象深刻的就是Gated CW-STED (gSTED)了，gSTED 使用更低的STED激光強(qiáng)度達(dá)到了比CW STED更好的分辨率，同時(shí)使用基于熒光壽命的時(shí)間門(mén)控技術(shù)用戶(hù)可以輕松地去掉592nm受激幅射光帶來(lái)的一些信號(hào)損失和模糊，這時(shí)候STED的分辨率提升到現(xiàn)在大家熟知的50nm。gSTED技術(shù)讓生物用戶(hù)可以使用非常熟悉的EGFP、AF488、mCherry等染料或熒光蛋白進(jìn)行STED成像。雖然很多常用成像探針無(wú)法將STED效果發(fā)揮到j(luò)i致，但是對(duì)于生物學(xué)家而言，他們更偏向于不必?fù)Q實(shí)驗(yàn)體系就能實(shí)現(xiàn)研究目的。這是熒光壽命技術(shù)最初在STED商業(yè)化產(chǎn)品中的應(yīng)用，最近幾年這個(gè)領(lǐng)域又有很多進(jìn)展，一直持續(xù)不斷給使用者們帶來(lái)驚喜。

圖2. gSTED對(duì)成像效果的改善

2016年我們單位購(gòu)置了第一臺(tái)受激發(fā)射耗損顯微術(shù)，型號(hào)是TCS SP8 STED 3X。這時(shí)候紅外熒光染料對(duì)應(yīng)的受激幅射光已經(jīng)從750nm的連續(xù)激光升級(jí)成了775nm的脈沖激光，我們發(fā)現(xiàn)775nm的STED成像分辨率遠(yuǎn)高于以前的任何波長(zhǎng)的受激幅射光，在普通生物樣品中最佳分辨率竟然可以達(dá)到30-40nm。更神奇的是775nm的受激幅射光不再有連續(xù)受激輻射激光“一掃沒(méi)"的現(xiàn)象（592/660nm連續(xù)激光掃過(guò)樣品一次以后很多常見(jiàn)熒光探針淬滅現(xiàn)象嚴(yán)重，俗稱(chēng)“一掃沒(méi)"），我們甚至可以使用775nm的STED成像模式進(jìn)行預(yù)覽來(lái)找到更合適的拍攝位置、甚至還可以進(jìn)行多層Z STACK掃描、甚至還可以做點(diǎn)活細(xì)胞STED成像。與之對(duì)應(yīng)的是，這時(shí)候受激幅射光的形狀調(diào)制也引入了新方法，除了在xy維度上可以提升分辨率，z軸維度上也可以使用3D STED技術(shù)來(lái)提高分辨率了。

至此，對(duì)普通生物用戶(hù)而言，如果使用775nm友好的紅色和紅外染料，這時(shí)的雙通道STED成像和常規(guī)共聚焦一樣簡(jiǎn)單了；這些染料和gSTED聯(lián)用可以實(shí)現(xiàn)更多通道的STED成像。而最近幾年熒光染料的發(fā)展涌現(xiàn)了很多l(xiāng)ong stoke位移的熒光染料，比如abberior STAR 460L、abberior STAR 520L等，也可以使用775nm的脈沖激光作為受激幅射光進(jìn)行3-5色的STED成像。這些成像和制樣技術(shù)的進(jìn)步使得制樣難度大大降低。而同一時(shí)期，我們也開(kāi)始了從純化染色質(zhì)到細(xì)菌、細(xì)胞、腦片、線(xiàn)蟲(chóng)和完整果蠅腦等較廣泛生物樣品的STED成像^[6-9]。

圖3. STED在線(xiàn)蟲(chóng)過(guò)氧化物酶體中的應(yīng)用

STELLARIS 時(shí)代

光毒性更小、通道更多

雖然基于熒光壽命的STED性能提升在SP8時(shí)代已經(jīng)開(kāi)啟，但是真正作為獨(dú)立實(shí)用工具的推出是在2020年前后的STELLARIS平臺(tái)。在gSTED通過(guò)簡(jiǎn)單設(shè)置hyD檢測(cè)器門(mén)控時(shí)間的基礎(chǔ)上，研究者們發(fā)現(xiàn)優(yōu)化FLIM數(shù)據(jù)的分析可以進(jìn)一步地提高STED的成像分辨率。在熒光光子數(shù)和分辨率平衡的基礎(chǔ)上，F(xiàn)LIM-STED達(dá)到相應(yīng)的分辨率只需要使用傳統(tǒng)STED 1/3到1/4的損耗光強(qiáng)度來(lái)成像便可達(dá)到常規(guī)STED的成像效果。因此，這種TauSTED技術(shù)可以在較厚樣品成像中對(duì)z軸采集更多層的信號(hào)，也可以在活細(xì)胞成像中采集更多幀數(shù)，進(jìn)一步拓寬了成像應(yīng)用范圍。

與之相應(yīng)的，不同STED顯微鏡廠(chǎng)家也改進(jìn)了STED技術(shù)在厚樣品成像中應(yīng)用，使用更適合生物樣品折射率的甘油物鏡、硅油物鏡或者水鏡以及特別的照明方式，讓使用者更容易對(duì)樣品較深的位置進(jìn)行STED成像或者進(jìn)行更厚的信號(hào)采集。2023年，有實(shí)驗(yàn)室報(bào)道了使用硅油物鏡對(duì)19.3x15x6 μm3的較厚活腦片進(jìn)行xyzt 4維成像，為光學(xué)成像技術(shù)在突觸分辨率水平對(duì)活體大腦組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)功能研究打開(kāi)了新的研究途徑^[10]。

圖4. 3D STED技術(shù)在信號(hào)密集的活體厚腦片成像中的應(yīng)用

除此之外，基于熒光壽命光譜拆分的成像方法最近二十年也一直是成像領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。早在2017年Hell團(tuán)隊(duì)就報(bào)道了使用612 nm的激發(fā)光和 775 nm的受激幅射光對(duì)ATTO 594、Abberior STAR 635P、KK1441、CF680R標(biāo)記的樣品進(jìn)行STED成像并進(jìn)行光譜拆分得到多通道成像結(jié)果的方法^[11]。隨著近幾年光譜向量拆分技術(shù)的成熟，使得這個(gè)方法對(duì)不同通道信號(hào)亮度的差異越來(lái)越寬容，常規(guī)生物樣品即可進(jìn)行5-6色的拆分^[12]。

圖5. 基于向量拆分的5色STED成像

STED 標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展

除了儀器的進(jìn)步之外，標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)步也在推動(dòng)著STED成像技術(shù)在科學(xué)研究中的應(yīng)用^[13]。理想的STED熒光探針應(yīng)該在受激輻射成像區(qū)域內(nèi)wanquan耗盡且盡量低的產(chǎn)生噪聲，亦不需要使用太強(qiáng)的受激輻射激光，從而提高STED的分辨率并減少 STED 帶來(lái)的光漂白，因此熒光探針的理化性質(zhì)對(duì)STED在科學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用影響巨大。最初的STED應(yīng)用中，研究者們主要篩選適合進(jìn)行STED成像的傳統(tǒng)熒光染料或熒光蛋白，主要有BD Horizon V500、NBD-X、Alexa 488、eYFP等。

很快大家發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)熒光探針在實(shí)際應(yīng)用中遇到一些挑戰(zhàn)，需要從以下幾點(diǎn)來(lái)開(kāi)發(fā)更適合STED成像的熒光探針：

提高光穩(wěn)定性。

提高STED損耗效率。

降低受激輻射損耗背景噪音。

提高生物相容性。

減少受激幅射光對(duì)其他熒光探針的淬滅。

降低標(biāo)記方法帶來(lái)的定位精度偏差。

基于這些需求，研究者們開(kāi)發(fā)出了STED友好的熒光蛋白 (iRFP、TagRFP657、mNeptune2、mGarnet2等)、STED友好的有機(jī)染料（Star家族、SiR等，可連接到抗體上也可以用HaloTag 或SNAPTag靶向到活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)）、避免被592nm或660nm強(qiáng)激光漂白的long stoke位移的熒光染料和標(biāo)記物和目標(biāo)區(qū)域距離更小的納米抗體等，使得STED技術(shù)更加廣泛地應(yīng)用到生物研究中。

總結(jié)和展望

作為一種對(duì)圖像重構(gòu)技術(shù)依賴(lài)較小、且樣品制備相對(duì)簡(jiǎn)單的納米顯微成像技術(shù)，STED得到了很多生物學(xué)研究者們的青睞，在二十多年的技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用中不斷迭代，應(yīng)用到越來(lái)越多的領(lǐng)域，也取得了很多成就，為推動(dòng)生命科學(xué)研究在納米空間拓展做出了很多的貢獻(xiàn)。

但是由于受激輻射相關(guān)的分辨率提高技術(shù)對(duì)熒光分子標(biāo)記密度和均勻性要求較高，在分辨率極限附近我們經(jīng)常需要使用電鏡等技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。而在活細(xì)胞或厚樣品成像中，光毒性和光淬滅依然是需要進(jìn)一步解決的問(wèn)題，這有賴(lài)于成像技術(shù)、標(biāo)記探針和制樣方法等多方面的進(jìn)步。技術(shù)在現(xiàn)實(shí)領(lǐng)域中推廣時(shí)總是會(huì)遇到復(fù)雜維度的需求，期待STED技術(shù)在現(xiàn)實(shí)樣品應(yīng)用中帶來(lái)更多貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：（上下滑動(dòng)查看更多）

1.托馬斯.庫(kù)恩科學(xué)革命的結(jié)構(gòu)【M】金吾倫、胡新譯北京：北京大學(xué)出版社2017

2.Milestones in light microscopy. Nat Cell Biol. 2009 Oct;11(10):1165.

3.Abbe E. Beitr?ge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Arch. Für Mikrosk. Anat. 1873;9:413–468.

4.Hell SW, Wichmann J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 1994 Jun 1;19(11):780-2.

5.Klar TA, Engel E, Hell SW. Breaking Abbe's diffraction resolution limit in fluorescence microscopy with stimulated emission depletion beams of various shapes. Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 2001 Dec;64(6 Pt 2):066613.

6.Zhou S, Xiang H, Liu JL. CTP synthase forms cytoophidia in archaea. J Genet Genomics. 2020 Apr 20;47(4):213-223.

7.Li N, Hua B, Chen Q, Teng F, Ruan M, Zhu M, Zhang L, Huo Y, Liu H, Zhuang M, Shen H, Zhu H. A sphingolipid-mTORC1 nutrient-sensing pathway regulates animal development by an intestinal peroxisome relocation-based gut-brain crosstalk. Cell Rep. 2022 Jul 26;40(4):111140.

8.Fang YF, Li YL, Li XM, Liu JL. Super-Resolution Imaging Reveals Dynamic Reticular Cytoophidia. Int J Mol Sci. 2022 Oct 2;23(19):11698.

9.Wang T, Shi S, Shi Y, Jiang P, Hu G, Ye Q, Shi Z, Yu K, Wang C, Fan G, Zhao S, Ma H, Chang ACY, Li Z, Bian Q, Lin CP. Chemical-induced phase transition and global conformational reorganization of chromatin. Nat Commun. 2023 Sep 9;14(1):5556.

10.Gonzalez Pisfil M, Nadelson I, Bergner B, Rottmeier S, Thomae AW, Dietzel S. Stimulated emission depletion microscopy with a single depletion laser using five fluorochromes and fluorescence lifetime phasor separation. Sci Rep. 2022 Aug 18;12(1):14027.

11.Gonzalez Pisfil M, Nadelson I, Bergner B, Rottmeier S, Thomae AW, Dietzel S. Stimulated emission depletion microscopy with a single depletion laser using five fluorochromes and fluorescence lifetime phasor separation. Sci Rep. 2022 Aug 18;12(1):14027.

12.Velicky P, Miguel E, Michalska JM, Lyudchik J, Wei D, Lin Z, Watson JF, Troidl J, Beyer J, Ben-Simon Y, Sommer C, Jahr W, Cenameri A, Broichhagen J, Grant SGN, Jonas P, Novarino G, Pfister H, Bickel B, Danzl JG. Dense 4D nanoscale reconstruction of living brain tissue. Nat Methods. 2023 Aug;20(8):1256-1265.

13.Jeong S, Widengren J, Lee JC. Fluorescent Probes for STED Optical Nanoscopy. Nanomaterials (Basel). 2021 Dec 22;12(1):21.

相關(guān)產(chǎn)品

STELLARIS STED